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分光光度计的结构与使用方法
日期：2025-05-11 12:49
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摘要：分光光度计的结构与使用方法
分光光度计的结构与使用方法
1.2 特点：灵敏、准确、快速、简便，在复杂的组分体系中，无需分离，即可以检测其中所含的极少量物质。
1.3 应用：生物<>化学研究中广泛使用的方法之一，广泛应用于糖类、蛋白质、核酸、酶类等的快速定量检测。
二、分光光度计的基本结构和工作原理
2.1 分光光度计的分类
2.2 分光光度计工作原理
2.3 分光光度计的基本结构\ n2.4 分光光度计的测量误差
2.5 显色反应及其影响因素
2.1 分光光度计的分类
分光光度计的分类
红外分光光度计：测量波长范围大于 760 nm 红外光区
可见分光光度计：测量波长范围为400~760 nm的可见光区
紫外分光光度计：测量波长范围为200~400 nm的紫外区
2.2 分光光度计的工作原理
人眼可见的光只占电磁波谱（400~760nm）的一小部分
它是一种频率较大的电磁波。电磁波是根据频率，从频率*小的无线电波到频率*大的γ-射线排列成一排，即电磁波的频谱，如下图所示。
2.2.1 分光光度计的光谱范围
包括波长范围为400~760 nm的可见光区和波长范围为200~400 nm的紫外光 不同的光源有其独特的发射光谱，因此可以使用不同的发光体作为仪器的光源.
钨灯发射光谱：钨灯光源发出的400～760nm波长的光谱，光线经棱镜折射后，由红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫组成的连续色谱图可以获得;该色谱图可作为可见光分光光度计的光源。
氢灯发射光谱：氢灯可发射185～400 nm波长光谱，可作为紫外光度计的光源。
2.2.2 物质的吸收光谱(1)
如果将某种物质的溶液放在光源和棱镜之间，此时屏幕上显示的光谱就不再是光源的光谱了。它有几条暗线，就是光中某些波长的光被溶液吸收后的光谱称为溶液的吸收光谱。
不同物质的吸收光谱是不同的。因此，根据吸收光谱，可以识别溶液中所含的物质。
2.2.2 物质的吸收光谱(2)\ n 当光通过某种物质的溶液时，透射光的强度减弱。由于部分光在溶液表面发生反射或散射，部分光被构成溶液的物质吸收，只有部分光能通过溶液。
入射光=反射光+散射光+吸收光+透射光
如果我们用蒸馏水（或构成此溶液的溶剂）作为“空白”来校正由于反射、色散等因素造成的入射光损失，则：
入射光 = 吸收光 + 透射光
2.2.3 物质的吸光度（A）与透射率（T）的关系
令I0为空白校正后的入射光强度； I 是透射光的强度。
根据实验，I = I0 ?10-εc l
式中，c表示吸波材料的摩尔浓度； l 表示吸波材料的光路，单位为cm； ε表示吸光材料的摩尔消光系数，表示物质的光吸收特性。不同的物质有不同的ε值。所以 I / I0 = 10-εc l
令 T（透射率）= I / I 0 T = 10-εcl
如果用 T 为吸波材料绘制浓度，则得到图 1-5-2 中的曲线。
由上式可知，1g(1/T) = εc l
lg(l/T) 是物质的吸光度 (A) A = 1g (1/T)
2.2.4 朗伯-比尔定律（E = εc l）
上式表明，物质的吸光度与吸收物质的浓度和液层厚度成正比。这就是光吸收的基本定律——兰伯特-比尔（Lambert-Beer）定律。
2.3 分光光度计基本结构
无论是哪种类型的分光光度计，它都包括：光源、单色器、吸收池、检测器和测量仪器。光度计各部件排列顺序如图：
5个基本部分
分光光度计基本部件（一）：
光源：分光光度计上常用的光源有两种：钨丝灯或氢灯，在可见光区、近紫外光区和近红外光区，常用钨丝灯作为光源；在紫外光领域，多采用氢弧灯。
单色器：划分混合光解析为单波长光的装置。它通常用作分光光度计中的色散元件。
Absorption cell cuvette, cuvette, cuvette) 一般由玻璃、石英或熔融石英制成，用于盛装待测溶液。在 350 nm 以下的紫外区工作时，必须使用石英池或熔融石英池。
分光光度计的基本组成（二）：
吸收池（比色皿）必须是 光束方向是垂直的。此外，每组比色皿的厚度应完全相同，以免出现错误。比色皿壁上的指纹、油渍或沉积物会显着影响其透光率，因此在使用前务必彻底清洁它们。
常用的光电池有光电管和光电倍增管三种。
测量装置——常用的紫外和可见光分光光度计有三种测量装置，即电流表、记录仪和数字读数单元现代仪器往往配备有自动记录仪，可以自动跟踪吸收曲线。
探测器
棱镜和光栅
棱镜：光波通过棱镜时，不同波长的光的折射率不同；因此，不同波长的光可以分开。玻璃对紫外光有很强的吸收作用，所以玻璃棱镜多用于可见光分光光度计。石英棱镜可以将光传播到整个紫外光区域，因此被广泛应用于紫外光分光光度计中。
衍射光栅：在石英或玻璃表面雕刻出许多平行线（每英寸约15 000-30 000条）。由于划线是不透明的，光的干涉和衍射使较长的光波偏转角变大，而较短的光波偏转角小，从而形成光谱。
棱镜单色仪装置示意图
光源在照射棱镜（或光栅）之前，必须先通过一个入射狭缝，然后用平行光镜使平行光束投射到棱镜上，通过棱镜的光再通过另一个聚光镜，在聚光镜的焦平面上可以获得清晰的光谱。例如，将发射狭缝置于焦线上，通过旋转棱镜移动光谱，就可以从发射狭缝发出所需的单色光。整个设备被称为“单色仪”
探测器---光电管
光电管安装在一个特殊的盒子中，由三层物质组成的圆形或矩形片组成。**层 是一种导电性好的金属，是光伏电池的负极。中间很薄的一层是半导体硒，第三层是铁，是光伏电池的正极。当光伏电池受到光照射时，半导体硒表面会逸出电子。 ，这些电子只往负极的方向移动，而不是正极，所以上下金属片之间会产生电流。位置差，连接线时会产生电流
探测器---光电管
光电管 光电管由封装在真空透明外壳中的半圆柱形阴极和丝阳极组成。阴极上有凹图。一层光发射材料，这种物质在被光照射时可以发射电子。当在两个电极之间施加电位时，发射的电子流向丝阳极以产生光电流。对于相同的辐射强度，它产生的电流大约是光电池产生的电流的1/4。由于光电管电阻大，产生的电流容易放大。
检测器---光电倍增管
光电倍增管优于普通光电管。将首 次发射的电子数放大到数百万倍。当电子撞击兼性阳极时，会导致更多的电子从表面弹出。这些射出的电子被第 二个兼性阳极吸引。 , 它还产生更多的电子。
这个过程重复 9 次后，每个光子可以形成 106 到 107 个电子。这些电子*终被收集在阳极上。得到的倍增器电流可以进一步放大和测量。
[$页$]
2.4 分光光度法测量误差
分光光度法测量误差
选择合适波长的入射光
控制吸光度范围A
选择合适的参考溶液
仪器测量
测量误差
测量条
项目选择
2.4.1 仪器测量误差
根据朗伯-比尔定律，可以知道只有在一定的浓度范围内，即在一定的吸光度范围内，由光谱光度计测量引起的测量结果的相对误差较小；当透光率接近0或1.0时，相对误差趋于无穷大；一般透光率百分比在10%～80%之间（即吸光度在1～0.1之间），浓度测量的相对误差较小；对于高精度仪器，当吸光度A=0.7-0.2（透光率百分比约为20-60%）时，测量误差约为1%。
2.4.2 测量条件的选择
(1)选择合适波长的入射光：由于有色物质选择性吸收光，为了使测量结果更灵敏，必须选择溶液*大吸收波长的入射光。
(2)控制吸光度A的准确读数范围：根据朗伯-比尔定律，吸光度仅控制在0.2~0.7读数范围内，测量的准确度更高。
(3)选择参考溶液：参考溶液用于调整仪器的工作零点。蒸馏水无色可作为样品溶液、试剂、显色剂的参比溶液；否则，应使用不含显色剂的样品溶液作为参比溶液。
一、分光光度法的定义及应用
1.1 定义：分光光度法是利用物质特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的分析检测技术。1.2 特点：灵敏、准确、快速、简便，在复杂的组分体系中，无需分离，即可以检测其中所含的极少量物质。
1.3 应用：生物<>化学研究中广泛使用的方法之一，广泛应用于糖类、蛋白质、核酸、酶类等的快速定量检测。
二、分光光度计的基本结构和工作原理
2.1 分光光度计的分类
2.2 分光光度计工作原理
2.3 分光光度计的基本结构\ n2.4 分光光度计的测量误差
2.5 显色反应及其影响因素
2.1 分光光度计的分类
分光光度计的分类
红外分光光度计：测量波长范围大于 760 nm 红外光区
可见分光光度计：测量波长范围为400~760 nm的可见光区
紫外分光光度计：测量波长范围为200~400 nm的紫外区
2.2 分光光度计的工作原理
人眼可见的光只占电磁波谱（400~760nm）的一小部分
它是一种频率较大的电磁波。电磁波是根据频率，从频率*小的无线电波到频率*大的γ-射线排列成一排，即电磁波的频谱，如下图所示。
2.2.1 分光光度计的光谱范围
包括波长范围为400~760 nm的可见光区和波长范围为200~400 nm的紫外光 不同的光源有其独特的发射光谱，因此可以使用不同的发光体作为仪器的光源.
钨灯发射光谱：钨灯光源发出的400～760nm波长的光谱，光线经棱镜折射后，由红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫组成的连续色谱图可以获得;该色谱图可作为可见光分光光度计的光源。
氢灯发射光谱：氢灯可发射185～400 nm波长光谱，可作为紫外光度计的光源。
2.2.2 物质的吸收光谱(1)
如果将某种物质的溶液放在光源和棱镜之间，此时屏幕上显示的光谱就不再是光源的光谱了。它有几条暗线，就是光中某些波长的光被溶液吸收后的光谱称为溶液的吸收光谱。
不同物质的吸收光谱是不同的。因此，根据吸收光谱，可以识别溶液中所含的物质。
2.2.2 物质的吸收光谱(2)\ n 当光通过某种物质的溶液时，透射光的强度减弱。由于部分光在溶液表面发生反射或散射，部分光被构成溶液的物质吸收，只有部分光能通过溶液。
入射光=反射光+散射光+吸收光+透射光
如果我们用蒸馏水（或构成此溶液的溶剂）作为“空白”来校正由于反射、色散等因素造成的入射光损失，则：
入射光 = 吸收光 + 透射光
2.2.3 物质的吸光度（A）与透射率（T）的关系
令I0为空白校正后的入射光强度； I 是透射光的强度。
根据实验，I = I0 ?10-εc l
式中，c表示吸波材料的摩尔浓度； l 表示吸波材料的光路，单位为cm； ε表示吸光材料的摩尔消光系数，表示物质的光吸收特性。不同的物质有不同的ε值。所以 I / I0 = 10-εc l
令 T（透射率）= I / I 0 T = 10-εcl
如果用 T 为吸波材料绘制浓度，则得到图 1-5-2 中的曲线。
由上式可知，1g(1/T) = εc l
lg(l/T) 是物质的吸光度 (A) A = 1g (1/T)
2.2.4 朗伯-比尔定律（E = εc l）
上式表明，物质的吸光度与吸收物质的浓度和液层厚度成正比。这就是光吸收的基本定律——兰伯特-比尔（Lambert-Beer）定律。
2.3 分光光度计基本结构
无论是哪种类型的分光光度计，它都包括：光源、单色器、吸收池、检测器和测量仪器。光度计各部件排列顺序如图：
5个基本部分
分光光度计基本部件（一）：
光源：分光光度计上常用的光源有两种：钨丝灯或氢灯，在可见光区、近紫外光区和近红外光区，常用钨丝灯作为光源；在紫外光领域，多采用氢弧灯。
单色器：划分混合光解析为单波长光的装置。它通常用作分光光度计中的色散元件。
Absorption cell cuvette, cuvette, cuvette) 一般由玻璃、石英或熔融石英制成，用于盛装待测溶液。在 350 nm 以下的紫外区工作时，必须使用石英池或熔融石英池。
分光光度计的基本组成（二）：
吸收池（比色皿）必须是 光束方向是垂直的。此外，每组比色皿的厚度应完全相同，以免出现错误。比色皿壁上的指纹、油渍或沉积物会显着影响其透光率，因此在使用前务必彻底清洁它们。
常用的光电池有光电管和光电倍增管三种。
测量装置——常用的紫外和可见光分光光度计有三种测量装置，即电流表、记录仪和数字读数单元现代仪器往往配备有自动记录仪，可以自动跟踪吸收曲线。
探测器
棱镜和光栅
棱镜：光波通过棱镜时，不同波长的光的折射率不同；因此，不同波长的光可以分开。玻璃对紫外光有很强的吸收作用，所以玻璃棱镜多用于可见光分光光度计。石英棱镜可以将光传播到整个紫外光区域，因此被广泛应用于紫外光分光光度计中。
衍射光栅：在石英或玻璃表面雕刻出许多平行线（每英寸约15 000-30 000条）。由于划线是不透明的，光的干涉和衍射使较长的光波偏转角变大，而较短的光波偏转角小，从而形成光谱。
棱镜单色仪装置示意图
光源在照射棱镜（或光栅）之前，必须先通过一个入射狭缝，然后用平行光镜使平行光束投射到棱镜上，通过棱镜的光再通过另一个聚光镜，在聚光镜的焦平面上可以获得清晰的光谱。例如，将发射狭缝置于焦线上，通过旋转棱镜移动光谱，就可以从发射狭缝发出所需的单色光。整个设备被称为“单色仪”
探测器---光电管
光电管安装在一个特殊的盒子中，由三层物质组成的圆形或矩形片组成。**层 是一种导电性好的金属，是光伏电池的负极。中间很薄的一层是半导体硒，第三层是铁，是光伏电池的正极。当光伏电池受到光照射时，半导体硒表面会逸出电子。 ，这些电子只往负极的方向移动，而不是正极，所以上下金属片之间会产生电流。位置差，连接线时会产生电流
探测器---光电管
光电管 光电管由封装在真空透明外壳中的半圆柱形阴极和丝阳极组成。阴极上有凹图。一层光发射材料，这种物质在被光照射时可以发射电子。当在两个电极之间施加电位时，发射的电子流向丝阳极以产生光电流。对于相同的辐射强度，它产生的电流大约是光电池产生的电流的1/4。由于光电管电阻大，产生的电流容易放大。
检测器---光电倍增管
光电倍增管优于普通光电管。将首 次发射的电子数放大到数百万倍。当电子撞击兼性阳极时，会导致更多的电子从表面弹出。这些射出的电子被第 二个兼性阳极吸引。 , 它还产生更多的电子。
这个过程重复 9 次后，每个光子可以形成 106 到 107 个电子。这些电子*终被收集在阳极上。得到的倍增器电流可以进一步放大和测量。
[$页$]
2.4 分光光度法测量误差
分光光度法测量误差
选择合适波长的入射光
控制吸光度范围A
选择合适的参考溶液
仪器测量
测量误差
测量条
项目选择
2.4.1 仪器测量误差
根据朗伯-比尔定律，可以知道只有在一定的浓度范围内，即在一定的吸光度范围内，由光谱光度计测量引起的测量结果的相对误差较小；当透光率接近0或1.0时，相对误差趋于无穷大；一般透光率百分比在10%～80%之间（即吸光度在1～0.1之间），浓度测量的相对误差较小；对于高精度仪器，当吸光度A=0.7-0.2（透光率百分比约为20-60%）时，测量误差约为1%。
2.4.2 测量条件的选择
(1)选择合适波长的入射光：由于有色物质选择性吸收光，为了使测量结果更灵敏，必须选择溶液*大吸收波长的入射光。
(2)控制吸光度A的准确读数范围：根据朗伯-比尔定律，吸光度仅控制在0.2~0.7读数范围内，测量的准确度更高。
(3)选择参考溶液：参考溶液用于调整仪器的工作零点。蒸馏水无色可作为样品溶液、试剂、显色剂的参比溶液；否则，应使用不含显色剂的样品溶液作为参比溶液。